항체공학-단일클론항체와 항체가변영역 유전자의 클로닝

 

 

제2장. 단일클론항체와 항체가변영역 유전자의 클로닝

다음을 설명하시오.

1.    Monoclonal antibody

단 하나의 항원결정기에만 대응하는 항체. 이러한 항체는 항원을 동물체에 주입하는 방법으로는 얻을 수 없었는데, 항체를 만들어내는 B세포와 골수종세포를 융합시켜 만든 혼성세포(hybridoma)에 의해 시험관 내에서 순수한 단일클론성항체를 만들어냈다

-단일클론 항체(monoclonal antibody)

: 한가지 특이한 epitope(항원의 세포 표면을 인식하는 부위)만을 인식하여 특이적으로 반응하여 특정 단백질을 분리하거나 동정할 수 있다.

+ mAb의 진단 및 치료에의 이용 • 진단 목적: 항원에 결합하는 mAb만을 제작(ELISA) • 치료 목적: 항원에 결합하여 기능을 저해하는 mAb를 개발 (고부가 가치로서 경제적 이익 창출 및 새로운 치료제 개발로 인류 건강 증진에 기여) - 인체에 부작용이 없고 치료 효능이 좋은 항체 치료제를 개발하는 것이 중요 (항체공학 기술의 핵심)

2.    Myeloma

골수에 있는 형질세포가 비정상적으로 분화하고 증식해 나타나는 혈액암.

 

형질세포(plasma cell)는 골수의 조혈모세포(stem cell)에서 유래되며, B림프구가 항원에 자극을 받아 최종적으로 분화된 세포이다. 형질세포는 우리의 몸에서 면역체계의 중요한 부분을 담당하며 바이러스와 같은 병원체를 공격하는 항체(antibody)를 생산한다. 다발성 골수종은 형질세포가 비정상적으로 분화 및 증식되어 나타나는 혈액암이다. 이러한 비++정상적인 형질세포를 골수종세포(myeloma cell)라고 부르며, 이는 종양을 만들고 뼈를 녹여 통증을 유발하고 잘 부러지게 하며, 골수를 침범하여 백혈구, 적혈구, 혈소판 수치를 감소시켜 빈혈, 감염, 및 출혈의 위험도가 증가하게 된다. 골수종세포는 또한 비정상 면역단백인 M단백(M protein)을 만들어 내는데, 이로 인해 혈액의 농도가 진해져서 혈액과점도증후군을 초래하거나 신장에 손상을 주기도 한다.다발성 골수종은 흑인남자, 남자, 고령(65세 이상)에서 많이 발생하고, 우리나라의 경우 최근에 점차 발생 빈도가 증가하고 있는 추세이다.

3.    Hybridoma

넓은 의미로는 2종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 종양성을 갖는 잡종세포. 일반적으로는 형질세포종과 B세포(B림프구)의 잡종세포를 가리킨다. 면역된 개체로부터 분리한 B세포는 형질세포종세포와 융합함으로써 항체를 배양 내에서 계속 만들어 낼 수 있다. 이러한 항체는 1개의 림프구로부터 유래하는 모노클로널항체이고 높은 특이성을 가진다.

하이브리도마, 림프잡종세포종in vitro에서 특이적인 단클론성(monoclonal) 항체를 생산하기 위하여 사용되는 잡종세포배양으로서, 림프구계 종양세포의 조직배양에 의하여 수립된 세포계와 특이적 항체 생산세포를 세포융합시켜서 만든다.

 

4.    HAT medium

선택배지의 하나이며 동물의 체세포유전학에서 가장 널리 이용되고 있다. 이 배지 중에서 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT) 결손 혹은 티민 키나아제(thymine kinase, TK) 결손균주는 생육되지 않는다. 따라서 이들의 세포에서 복귀돌연변이 세포의 선택 혹은 이들의 세포를 사용한 외래성 DNA에 의한 형질전환실험이나 양주세포의 융합실험 등으로 야생형세포를 선택하는 데 사용된다

HAT, 즉 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin), 티미딘(thymidine)을 포함하는 세포배양용 선택배지. DNA합성의 재료가 되는 뉴클레오티드를 만드는데 세포 내에는 신생경로(de novo pathway)와 재생경로(샐비지경로)가 있다. 아미노프테린은 신생경로를 저해하기 때문에 이것이 배지에 포함되고 있으면 세포는 재생경로에 의해서만 뉴클레오티드를 공급하지 않으면 안 되고 재생경로에 결핍을 갖는 세포는 증식할 수 없어 사멸한다.

 

5.    Indirect ELISA

- Indirect ELISA 에서 OD값이 높을수록 항체의 항원결합능이 높거나 항체의 양이 많음. - Sandwich ELISA에서 OD값이 높을수록 항체의 양이 많음. à Indirect ELISA OD/ Sandwich ELISA OD값이 높은 항체를 생산하는 hybridoma clones을 선택

Indirect ElISA는 두가지 단계로 이루어진 ELISA로 primary antibody binding 과정과 labeled secondary antibody binding 과정을 포함한다. 항원과 결합하는 항체(Primary antibody)에는 효소가 없고, 그 항체와 결합하는 항체(secondary antibody)에 효소가 결합되어 있는 분석 방법이다. 1차 항체는 표지되지 않지만, 1차 항체를 인식하는 enzyme-conjugated secondary antibody와 함께 검출된다. Secondary antibody는 신호를 증폭할 수 있고, 많은 2차 항체가 다른 assay에 사용될 수 있지만 교차 반응성이 발생할 수 있다. (교차반응성 – 일차적인 관심대상 분석체 외의 다른 물질에 항체가 결합하는 현상)

+ 효소면역정량법 (ELISA)는 오늘날 가장 널리 이용되는 면역정량법이다.

 

이 방법은 Ag-Ab interaction을 이용하여 Ag or Ab를 정성, 정량할 수 있는 감도가 매우 우수한 실험법 (수 ng/mL)이다. 이 방법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 항원-항체 분석법의 하나가 되고 있다. 1970년대 초 프랑스 (Avrameas와 Guilbert, 1971년)와 스웨덴 (Engvall과 Perlman, 1971년)에 있는 두 그룹에 의해 동시에 고안되었다.

 

이후, ELISA 의 많은 변형 이 서로 다른 상황에서 개발 되고 사용 되어 왔지만, 모두 아래 네 가지 동일한 기본 요소 에 따라 달라진다

 

6.    Sandwich ELISA

③ Sandwich ELISA

- 항원에 대한 항체를 먼저 플레이트에 결합시키고, 그 항체에 항원을 결합시킨 다음 직접법이나 간접법으로 조사하는 방법

- 항원의 양이 적을 때 또는 미지의 샘플에 들어 있는 항원을 조사할 때 사용한다.

a) 항원의 양을 측정,

b) 두 개의 항원-특이적 항체가 요구됨,

c) 합텐 검출에 적합하지 않음,

d) 민감도가 높음

+ Sandwich ELISA와 Indirect ELISA의차이점

Indirect ELISA는 plate위의 antigen에 primary antibody가 결합 후 그 항체에 secondary antibody가 결합하지만 sandwich ELISA는 capture Antibody가 먼저 plate에 결합된 후, 그 항체에 항원이 결합된다. 즉, 측정되는 항원이 capture 항체 층과 detection 항체 층 사이에 결합된다. 따라서 sandwich ELISA의 항원은 최소 2개 이상의 결합부위가 존재해야하며, 시료내 항원의 양이 적거나 미지의 샘플에 들어있는 항원 조사시에 적합하다.

 

7.    HAMA response

Human anti-mouse antibody or human anti-murine antibody (HAMA) is an antibody found in humans which reacts to immunoglobins found in mice

Antibody treatment is a type of therapy that is used to treat certain types of cancer and immune disorders. Antibodies are proteins which are naturally formed by the body in response to a foreign substance, known as an antigen. Antibodies can also be grown outside of the patient’s body and injected into them to help aid the immune system to fight disease. These types of antibodies are typically called monoclonal antibodies because they are created to target one specific antigen.[2] Herceptin and Avastin, two widely used cancer fighting drugs, are examples of monoclonal antibodies.

8.    Chimeric antibody

Construction of Chimeric Antibody - Recombinant antibody (mouse variable region and human constant region) • Cloning of mouse VH (heavy chain variable region) and VL (light chain variable region) genes • Selection of human heavy chain constant region (Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4) and human light chain constant region (Cκ, Cλ) • Construction of mouse VH - human Cγ and mouse VL – human Cκ • Cloning of the chimeric heavy and light chain genes into expression vector • Introduction of the expression plasmid into mammalian cells • Analysis of culture supernatant

단일클론 림프구로부터 얻어낸 항체의 가변부위를 암호화하는 DNA 영역으로 인간의 단일클론 림프구에 존재하는 같은 부위의 DNA 영역을 대체함으로써 Fc 부위는 인간의 것이지만, 가변부위는 쥐의 것인 잡종항체(Chimeric antibody)를 만들 수 있다.하지만 이 방법 역시 HAMA 반응을 완전히 나타나지 않게 할 수는 없었기 때문에 곧 항체의 가변 부위 중에서도 가장 끝 부분인 CDR 지역만을 대체하는 방법이 나타났다.이 방법은 부작용이 거의 나타나지 않는다. 그러나 문제는 재조합하기가 어렵다는 단점이 생긴다

잡종항체는 그냥 단백질의 한 영역(Domain) 단위로 떼어서 붙이는거지만 이 방법은 영역 내의 DNA 서열을 재조립하는 방식이다. 당연히 훨씬 어렵다.

 

그러나 이 방법 뿐만 아니라 전혀 다른 방법으로도 접근이 가능한데, 굳이 항체의 모양을 유지할 것 없이 조각만 떼어서 적절히 조립해보자는게 그 아이디어다.

9.    Rearrangement of germline heavy-chain DNA

HEAVY CHAIN : 중쇄의 다양성 경쇄와 마찬가지로 L, V, J, C region으로 이루어진 중쇄에는 여기에 추가로 D (diversity) region (D1...Dn)이라는 exon이 존재한다 In addition to several J exons, the heavy chain gene family also contains D (diversity) exons.

하나의 세포가 경쇄를 만들어낼 성숙한 B세포로 분화하면서, 중쇄 DNA rearrangement가 일어난다

중쇄 DNA 재배열

 

- D region이 J region과 가까워지도록 intron 제거

 

- V regions 가 DJ region과 가까워지도록 intron 제거

 

- V region과 가까운 Promoter (P)가 intron 제거 과정에서 Enhancer (E)와 가까워지면서 전사가 활성화 된다

 

- E 는 J 와 Cμ  사이에 위치.

 

- Promoter에서 전사가 시작되고, pre-mRNA는 nucleus에서 발생하는  mRNA splicing 과정을 통해 성숙 mRNA로 가공된다.

 

- cytoplasm에서 heavy chain(HC)으로 번역되어 ER lumen으로 분비된다

+ 가변부위 유전자의 재조합

 항체의 가변부위 유전자의 재조합은 항체의 다양성을 높여주는 기작 중 하나이다. 유전자 재조합이 일어날 때는 중쇄 가변부위 유전자가 먼저 재배열된 뒤, 경쇄 가변부위 유전자가 재배열된다.

+중쇄 유전자의 VDJ 재배열

 위 그림에서 보듯 중쇄 유전자의 가변부위에는 V, D, J 부분이 존재하는데, 이 중 V부분에서 절편 하나, D 부분에서 절편 하나, J 부분에서 절편 하나가 조합되어 항체 하나가 만들어진다. 좀 더 자세하게 살펴보자면 일단 유전자(DNA) 수준에서 VDJ재조합이 일어난 뒤, 이것이 RNA로 전사되고, 전사된 RNA가 RNA splicing과 Poly A tail을 붙이는 과정을 거치면서 mRNA로 된다. 이것이 번역의 과정을 거치면 단백질 형태인 항체가 되는 것이다.

 이렇게 되면 어떤 V절편, 어떤 D절편, 어떤 J절편이 선택되었는지에 따라 다양한 종류의 항체가 나타날 수 있다.

10. Rearrangement of germline kappa light-chain DNA

경쇄는 kappa와 lamda의 2가지가 존재하는데, 인간에서는 kappa : lamda가 6 : 4의 비율로 존재하는 반면,

생쥐의 경우 kappa : lamda 는 9.5 : 0.5의 비율로 존재한다.

kappa(κ) Light Chainκ 경쇄는 1 C region gene (Cκ)와 300 V region genes (Vκ1 ... Vκ300) 으로 이루어져있다. 마찬가지로 각  V region은 2 exon (L, V) 으로 이루어져있으며, λ 경쇄보다 더 다양한 종류의 J 부위가 joining region에 있다. 하나의 세포가 경쇄를 만들어낼 성숙한 B세포로 분화하면서,  경쇄 DNA rearrangement가 일어난다.

경쇄 DNA 재배열

- V region과 가까운 Promoter (P)가 intron 제거 과정에서 Enhancer (E)와 가까워지면서 전사가 활성화 된다

- E 는 J 와 C region 사이에 위치.

- Promoter에서 전사가 시작되고, pre-mRNA는 mRNA splicing 과정을 통해 성숙 mRNA로 가공된다

+경쇄 유전자의 VJ 재배열

이것은 VJ 부분이 재조합된다. .. 중쇄는 V, D, J 부분에서 절편이 하나씩 선택되는 재조합인 반면, 경쇄는 V부분과 J부분 절편이 하나씩 재조합된다.

각각 RAG1과 RAG2이 잘 결합할 수 있는 신호서열은. (각각 23 염기쌍과 12 염기쌍으로 구성됨) 이 신호서열에 RAG1, RAG2가 결합한 뒤, RAG1과 RAG2는 복합체를 형성한다. 그리고 형성된 복합체는 일부 유전자들을 떼어내고, 남아있는 부분은 hairpin구조(V와 DJ가 있는 부분의 U자형 부분)를 형성하게 된다.그리고.. 위와 같이 형성된 hairpin구조의 U자부분이 열리면서 hairpin구조끼리 서로 연결(위 그림에서는 V부분과 DJ부분이 연결되는 것)된다. 이 때 추가적으로 항체의 다양성을 제공하는 기전이 있는데.. 이것이 바로 P첨가(P-nucleotide addtion)와 N첨가(N-nucleotide addition)이다 그런데.. 유전자가 재배열되는 과정은 어떻게 일어날까? 재조합 활성 유전자(recombination activating gene)으로 암호화되는 단백질인 RAG1, RAG2가 위의 재배열 과정을 매개하게 된다.

11. Class switching

비 세포 또는 형질 세포가 아이지엠(IgM)의 생성으로부터 아이지지(IgG), 아이지에이(IgA) 혹은 아이지이(IgE) 생성으로 바뀌는 기전.

종류전환이라고도 한다. B전구세포는 골수에서 공급하는데 그 성숙과정은 크게 2단계로 구분한다. 첫 단계는 항원단계와는 관계없이 성숙분화하는 과정인데, 세포표면에 IgM 단위체를 항원수용체로 발견하는 과정까지이다. 이 단계에서 B세포의 면역글로불린 가변부 유전자(V-D-J유전자)의 재편성이 끝나고 있다. 다음 단계에서는 이 B세포가 항원자극을 받아 가변부 유전자로의 고빈도 돌연변이의 도입과 정상유전자(CH유전자)의 재편성을 유도하여 어느 하나의 항체종류를 분비, 생산하도록 고정한다.

 

12. Leader sequence

아미노산 생합성의 오페론 등에서 전사가 전사감쇠에 의해 조절되는 유전자에서 오페론의 촉진자로부터 감쇠기까지의 선도영역에 존재하는 순서. 저분자량의 선도펩티드를 코드한다. 선도서열은 오페론의 최종산물인 아미노산을 많이 코드하고, 리보솜이 이 펩티드를 번역하는 속도에 따라 오페론번역의 점멸(on-off)이 결정된다.

13. Expression plasmid

Plasmid가 벡터로 기능하기 위해 갖추어야할 조건에서

vector들은 복제가 잘되고, gene expression이 잘 되도록 최적화 시켜 놓아야한다.

 

+발현 벡터(Expression vector)는 클로닝한 유전자를 다른 생명체에 전달하여 발현 시키는데 최적화된 벡터이다. 생물체가 가지는 유전자 발현 및 조절 체계는 매우 복잡하기 때문에, 단순히 외부 숙주에 클로닝된 유전자를 삽입해서는 대부분 잘 발현되지 않는다. 이런 문제를 해결하기 위해 여러 숙주의 유전자 발현 체계에서 발현이 가능하도록 프로모터, 리보좀 결합부위, 다중 클로닝 부위(multi cloning site), 전사종결부위 등을 적절히 디자인한 발현 벡터가 고안되었다. 이는 단순히 높은 수준의 발현만을 목표로 하는 것이 아니라, 좀 더 정확한 발현 조절이 가능하도록 유도하는 것이 목적이다. 발현 벡터는 보통 전사 수준에서 조작이 가능하게끔 하는 여러 조절서열을 포함하고 있다. 유전자로부터 mRNA로의 전사 정도는 RNA 중합효소가 결합하는 프로모터 서열에 기반하기에, 프로모터의 선별 및 사용은 발현 조절에서 매우 중요한 요소이다. 예를 들어, 진핵생물의 프로모터를 해당 유전자와 같이 클로닝할 경우 대장균(E. coli)에서는 매우 낮은 수준의 전사만 일어나거나 전혀 전사되지 않기도 한다. 따라서 발현 벡터에는 숙주에서 클로닝된 유전자의 전사를 유도할 수 있는 프로모터가 있어야 한다.

14. Transfection

트랜스펙션(transfection)이란 정제된 바이러스 핵산이나 플라스미드를 진핵세포에 도입하는 것을 말한다. 대상 세포가 원핵세포일 경우 형질전환(transformation)이라고 한다. 핵산은 강한 음전하를 띠기 때문에, 똑같이 음전하를 띠고 있는 진핵세포의 세포막을 통과시키기 위해 화학적, 혹은 물리적인 방법을 이용한다. 화학적 방법에는 양이온, 양이온 중합체, 양이온 리포좀(liposome)등이 사용된다. 물리적으로는 DNA를 핵 안으로 직접 주입하는 미세주입 (microinjection)이나, 강한 전기장에 노출시켜 일시적으로 세포 막의 투과성을 높이는 전기천공법 (electroporation)이 사용되기도 한다

 

15. Affinity chromatography for purification of antibody

친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)는 항원과 항체, 효소와 기질 또는 수용체와 리간드 사이 같은 매우 특이적인 상호작용을 기반으로 생화학 혼합물을 분리하는 방법이다. 효소 및 기타 단백질과 같은 생물학적 거대 분자는 몇 가지 서로 다른 유형의 결합과 상호작용을 통해 높은 특이성을 갖는 다른 분자와 상호작용(수소결합, 이온 상호작용, 이황화결합, 소수성 상호작용 등을 포함)한다. 친화성 크로마토그래피는 원하는 물질이 고정상과 상호작용하는데, 이 둘 사이의 선택성이 상당히 높은 경우(즉, 낮은 농도에서도 결합할 수 있는 경우)에 사용될 수 있다. 따라서 특정 화학기에 친화력을 가진 단백질은 그 화학기를 가지는 컬럼(관; column) 내의 고정상 비드(구슬; bead)에 결합하고, 그 결과 컬럼을 빠져 나오지 못하게 된다. 즉, 컬럼 상에 머물게 되는 단백질은 비드에 가교 결합한 리간드와 특이적으로 결합하게 된다. (생화학에서 '리간드'는 단백질과 같은 거대 분자에 결합하는 그룹 또는 분자를 지칭하기 위해 사용된다.) 리간드에 결합하지 않는 단백질은 컬럼에 완충용액을 흘려 세척하고, 실험자가 원하는 단백질은 유리 리간드를 포함하는 친화성 용액 또는 pH가 낮거나 높은 용액(이들을 용출용액 elution buffer라고 부른다)으로 비드로부터 떼어내어 용출한다.

 

+단백질 정제라는 것은 이런 제각각의 다른 성질을 가진 단백질 중에서 자신이 원하는 단백질만을 슥 골라내는 일이다. 온갖 다양한 성질을 가지는 단백질 중에서 자신이 목적하는 단백질에만 특이적으로 결합하는 레진을 이용하여 자신이 원하는 골라내는 친화크로마토그래피는 단백질 정제에 가장 이상적인 툴이 된다.