생물물리화학방법론=Chromatography3

 

친화성을 이용 GSH만 결합 어떤종류의 레진을 사용하는지 결정, 태그로 결정 특이한 방식의 일루션을 사용

x축시간 y축 흡광도 원치않은 프로틴은 washing step  elution 원래상상태로

His tag 사이의 프로테이즈 를 잘라내는 시퀀스

아이맥은 쉽게 결합 할 수 있음 IMAC에 집어넣어 결합시켜줌 히스테인과 비슷한 모양을 가진

Affinity-

고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)

오픈칼럼-중력 아주낮은 정도의 압력을가해줄수있음

HPLC FPLC-높은농도 다양한 종류의 크로마토 그래피실행

FPLC 및 HPLCFPLC와 HPLC의 레진의 사이즈가 작아도됨 다양한종류의 크로마토그래피

특화되어있는 FPLC생체분자를 분리정제 , 프로틴이 안정한

• 유사성 ✓ 작은 입자 직경 고정상 사용 (5–13 μm) ✓ 다양한 크로마토 그래피에서 사용 가능 모드 ✓ 이동식 유량은에서 발생 가압 시스템합니다. ✓ 샘플 및 버퍼 구성 요소는 크로마토 그래피 전에 여과가 필요합니다.

• HPLC와 FPLC의 차이점 ✓FPLC는 바이오 폴리머의 요구에 맞게 특별히 설계되었습니다. ✓ 주로 수성 용매가 사용됩니다. 고정상은 비교적 큰 적재 능력을 갖는다. ✓FPLC는 HPLC보다 훨씬 낮은 압력에서 작동합니다. ✓ 누출은 덜 일반적입니다.

관류 크로마토 그래피

• 크로마토 그래피 성능은 입자 크기를 줄임으로써 향상되지만 시스템의 실제 압력 제한으로 인해 3–5 μm의 하한이 부과됩니다.

•이 제한은 관류를 사용하여 극복됩니다. POSOS (Perfusive Stationary Phase Particles)는 이동상의 빠른 확산을 촉진하는 큰 채널을 포함하여 매우 높은 유량, 적은 배압 및 짧은 작동 시간을 허용합니다.

막 기반 크로마토 그래피 시스템

• 입자 크기 제한을 해결하기위한 대안은 멤브레인 기반을 사용 아닌하는 것 입자 기반 정지상이입니다.

• 막 기반 크로마토 그래피에서 정지상은 서로 얇게 쌓인 얇은 다공성 막으로 구성됩니다. 이들은 이온 교환, 친 화성 또는 다른 그룹으로 코팅되어 다양한 크로마토 그래피 모드를 제공 할 수있다.

샘플 단백질의 크로마토 그래피 발현정제 디자인하기 위해 고려 이콜라이 이스트 인섹트 어떤 cell을 사용하느냐

프로틴 폴딩 으로인해 좋지않은경우도있음 폴딩은 접힘- linear- 접히게됨 제대호 접힘이되어 3차원적 구조를 가져야함

비용 -이콜라이 부터 inclusion이되는 경우를 생각 -refolding을 유도-ddt를 사용한다

정제 프로토콜 설계를위한 고려 사항

● 정제 프로토콜 (특정 단백질에 대한 정제 단계의 조합)을 설계 할 때 다음 사항을 고려해야합니다.

• 목표 단백질의 안정성 특성 ✓ 변성, 구조적 무결성 및 발현중 생물학적 활성의 부재

또는 정제✓ 열 및 pH에 대한 비정상적인 높은 안정성-관심있는 단백질에 영향을주지 않고 오염 단백질을 변성시키기위한 열 / pH 처리. ✓ 프로테아제 세포 추출물을 준비하는 동안 세포 내 소기관으로부터의는

단백질을 단백질 분 해적으로 분해하여 단백질을 분해합니다 – 프로테아제 억제제 또는 EDTA 사용 오플칼럼-비용이싸다 리간드 케미컬 두세가지 이용

• 발현 시스템 ✓ 대장균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포 ✓ 불용성 봉입체 (플라크)에주의 )과발현 동안

프로틴이 안정화 - 온도를 높여주면 불안정 온도를 낮춰주는게 필요 pH에 따라 charge가 달라짐 특정한 buffer안에 고온에 안정한경우도 많다 cell의 정상적인 활동 proteases를 저하 시킬수있는 inhibitor사용 EDTA-

특히에서 대장균 세포= 봉입체의 정제, 리 폴딩

샘플 단백질의 크로마토 그래피

정제 프로토콜 설계를위한 고려 사항

프로틴엑티브가 떨어질수도 tag-관심있는 프로틴에 태그 -프로테이즈로 제거가능

• 태그 ✓ 관심있는 단백질과사이의 융합 단백질의 발현

정제 태그(GST, His6, 플래그, 스트렙 II). 프로테아제 절단 부위의 포함은 정제 된 융합체로부터 친 화성 부위의 후속 제거를 허용한다.

• 고유 화학적 및 생물학적 특성 ✓수율을 최대화하려면 이러한 특성의 작은 차이를 이용하십시오

각 단계에서 다른 단백질의 수준을 최소화하면서 관심있는 단백질의. 차이는 사용 된 크로마토 그래피 모드를 결정합니다.

• 프로토콜 설계 ✓ 크로마토 그래피 모드 및 형식의 매트릭스를 최소화

를 활용하여 정제에 필요한 단계 수하고, 최종 생성물의 순도를 최대화하고 단백질을 본래 상태로 유지하여 생물학적 특성을 보존하십시오. ✓ 단계가 수행되는 순서를 고려하십시오.

샘플 단백질의 크로마토 그래피

정제 프로토콜 설계를위한 고려 사항

• 일반적으로 초기 단계에서는 추출물의 단백질 농도를 낮추고 개방 컬럼 크로마토 그래피 방법을 포함합니다.

• 후속 단계에서는 더 높은 성능 또는 해상도 방법이 사용됩니다.

• 정화 효율을 극대화하기 위해 다양한 조건을 평가하십시오. 예를 들어, 이온 교환 크로마토 그래피에서 다양한 구배 및 다양한 pH 값으로 시험 분리를 수행합니다. 친 화성 크로마토 그래피에서, 다양한 리간드 및 용리 기술이 평가 될 수있다.

• 관심있는 단백질의 생물학적 활성과 순도를 최대화하기 위해 크로마토 그래피 단계의 정확한 순서를 변경하는 효과를 연구하는 것이 유리할 수도 있습니다.

• 정제의 각 단계에서 단백질의 순도는 분석 크로마토 그래피 및 전기 영동 방법으로 평가됩니다.

정제 프로토콜의 예

단백질 발현 및 정제

발현 시스템 대장균, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포

발현 태그

가용성 또는 불용성 단백질? 세정제? 접는?

세포 용해법? 용해 버퍼? 프로테아제?

정제 방법 설계-태그, 단백질 고유 특성

✓ 친 화성 크로마토 그래피 (리간드?, 용출?) ✓ 이온 교환 크로마토 그래피 (pH ?, 염 농도?) ✓ 겔 여과 크로마토 그래피 (단백질 크기?)

✓ 소수성 상호 작용 크로마토 그래피? 황산 암모늄 침전? ✓ 열처리 / pH 처리?

1.homodimal -프로틴사이즈를 결정 SDS 디네이쳐 -complex가 안이룸

native / mass- denature 프로틴한개 모노몰 다이몰 구분 2345 -3문제

1. DNA와 아미노산 서열은 단백질이의 분자 질량가지고 있음을 시사

~ 15 kDa을하지만, 단백질이 원래 상태에서 동종이 량체로 발생할 수 있다고 생각되었다. 이것을 크로마토 그래피로 어떻게 확인할 수 있습니까?

연구팀은 인간 IL-99 (hIL-99) 수용체클로닝했다

를 확인하고 재조합 DNA 방법을 사용하여 유전자를 발현 벡터로. hIL-99 수용체의 재조합 단백질 발현은에서 수행되었다 대장균 세포. hIL-99 수용체에 대한 다음 정보를 기반으로 단백질 추출 및 정제 프로토콜을 설계하십시오.

•이 단백질은 N- 말단에 7 개의 연속 히스티딘 잔기 서열을 가지고 있습니다 (시퀀스 : N- 말단 His-His-His-His-His-His-His-Asp-Gly-Thr ...... C- 기간).

• 단백질은 발현 될 때 봉입체를 불용성 응집체로 형성 하였다.

• 단백질은 hIL-10에 결합 활성을 나타냅니다. hIL-99에 대한 단백질의 상호 작용에 대한 친화력해리 평형 상수 (K매우 높지만d은 1 nM의)로1 M MgCl의해 상호 작용이 쉽게 파괴된다2에, 관심있는 단백질을 변성시키지 않고 감소시키지 않는생물학적 활동. hIL-99가 상업적으로 이용 가능하고 매우 저렴하다고 가정 해 봅시다. 3차원적인 폴드 -7개의 히스티딘 /정상적인 삼차원적 구조 비정상적인 / IL-99결합 결합 각도 1nM이 더 강하게

MgCl  purity가 -refoliding linear soultion을 만듦