생물물리화학방법론-Chromatography

Chapter 2. Chromatography Liquid vs Gas Adsorption vs Partition Analytical vs Preparative Plane vs Column

Sample Mixer Tubing Mixer Pumps Pumps Injection valve Column Buffers/ solutions Fraction collector UV/Vis absorbance

Continuous flow elution or isocratic elution - Applied to partition chromatography Batch flow elution - Applied to adsorption chromatography - Stepwise increase of buffer B (e.g. ion strength, pH) - Conditions may be selected where one sample 단백질이 separationcomponent remains bound to the stationary phase while another elutes.

Gradient elution - Applied to adsorption chromatography - Continuous increase of buffer B (e.g. ion strength, pH) - Gradient elution needs to be performed to determine elution conditions for batch flow elution and is often used when scaling up chromatography for preparative separation such as in downstream processing of proteins. 천천히 농도를 높여줌

Chromatography equipment – elution (용리) 프로틴에 맞는 하이드로 포빅한 솔트가 들어닜는 솔루션을 넣어주고 어피니티 하여 특정한 단백질을 얻는다Modes of chromatography – ion exchange (IEX) 교환

• Ion exchange chromatography is a form of adsorption chromatography in which charged proteins or other biomolecules are exchanged for small ions of the same charge, originating in salts (e.g. Na+, Cl-), on the stationary phase of ion exchanger.

• Charges of proteins ✓ Proteins have a net change on their surface arising mainly from amino 프로틴마다 피아이 값이다름 DEAE-+가존재 -protein을 부착

acid side chains some of which possess either a positive or negative charge at a given pH. ✓ At highly acidic pH, most proteins possess net positive change while at CM-가존재highly alkaline pH they possess net negative charge. ✓ The pH at which a given protein possesses zero net charge is called the isoelectric point, pI. ✓ The surface charge and pI are dependent on the amino acid sequence of the protein. They may be regarded as characteristic physical properties that may be used to separate protein from each other in ion exchange chromatography. Modes of chromatography – ion exchange (IEX) +,-가결합, protein2가 빠져나감 • Charges of proteins • Charges of amino acids -단백질을 원하는 상태로 만들어줌

Modes of chromatography – ion exchange (IEX) positive charge elution을 세가지 protein으로 washing , 어떠한 ph charge가 따라 결정된다

Modes of chromatography – gel filtration (GF) 크로마토 그래피 모드 – 겔 여과 (GF)

• 겔 여과 (크기 배제, 분 자체) 크로마토 그래피 는 정의되고 좁은 크기 범위의 기공을 포함하는 비드를 사용하여 분자 크기를 구별하는 파티션 크로마토 그래피.

• 비드의 구멍 안에 들어가면, 생체 분자는 통과하는 채널에 유지됩니다. 배제 한계보다 큰 질량의 분자는 공극 부피에서 단일의 미해결 피크로 용리시키면서 컬럼을 자유롭게 통과합니다. 겔의 분별 범위 내의 분자는 그들의 질량에 일반적으로 반비례하는 방식으로 유지되며, 즉 더 작은 분자는 가장 오래 유지 된다 -작은 것은 마지막 , 모빌리티가 다르기 때문에, 패스도 제일 길어짐 .

"크기• Gel filtration (size exclusion, molecular sieve) chromatography is partition chromatography that differentiates molecular sizes using beads that contain pores of a defined and narrow size range.

 “Size-exclusion”

• 겔 여과 크로마토 그래피의 응용

1) 탈염 (예 : Sephadex G-25 (분획 범위 1) -5 kDa). 단백질 은 소금없이 공극 부피로 나옴) 또는 완충액 교환

2) 단백질의 "천연"질량 분석.

✓ 가정 : 단백질은 사용 된 표준의 단백질)과 모양이 비슷 ✓ 비특이적 결합에주의하십시오. size분리 알고있는 sample elution volume 이달라짐 관계식- sample로 추정  단일의 올리고머 상태 분석에 적용 할 수 있습니다 단백질 또는 단백질 복합체(겔 여과는 단백질의 고유 상태를 유지함) http://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ ✓의 크로마토 그램에서 관찰 된 두 피크의 분자 질량을 추정하십시오 추세선 분자량-elution 의 관계 , 반비례함 추정 할 수 있음

단일 단백질 시료. ✓ 두 피크의 올리고머 상태를 결정하십시오.된 분자량  아미노산 서열에 기초하여 계산은 65 kDa이다.

3) Protein purification purpose

-겔 여과 컬럼의 층 부피의 5 % 미만의 로딩 부피 -종종 정제 전략의 끝 근처에서 사용됨 연마 단계. -겔 여과와 이온 교환을 결합하면 두 단백질의 순 전하와 질량이 같지 않기 때문에 정제 효율이 크게 향상됩니다. ➢ 분해능에 대한 시료량의 영향

Modes of chromatography – Reversed phase (RP)

역상 크로마토 그래피 (RPC)사용하여 단백질 또는 펩타이드를 분리하고 분석합니다. 는 탄화수소와 같은 소수성 정지상과 분석 물의 소수성 상호 작용을사슬 (C-4, C-8, C-18). -하이드로 포빅• 샘플 성분은 소수성 상호 작용에 의해 소수성 사슬에 부착됩니다. • 시료 성분 이 증가하는 용매 (예 : 아세토 니트릴) 및 물의 감소 구배로 용리됩니다 (따라서 이동상의 소수성이 점진적으로 증가합니다). 극성 샘플 성분은 약한 소수성 상호 작용을 나타내며 시스템에서 먼저 용리되는 반면 비극성 성분은 나중에 용리됩니다. -유기용매 몰의 농도 감소• RPC는 종종사용 올리고 뉴클레오티드 및 펩타이드의 최종 폴리싱에분석 분리에 적합되며 펩타이드 매핑과 같은합니다. -3차원적 분리• 샘플 성분의 유지는 극성, 온도 및 pH에 매우 민감합니다.

• 활성 회복 및 올바른 3 차 구조로의 복귀가 필요한 경우 RPC는 일반적으로 단백질 정제에 권장되지 않습니다 많은 단백질이 유기 용매가있는 상태에서 변성되기 때문에. 그러나 예외가 존재합니다. Reversed phase vs. normal phase chromatography

Reversed phase chromatography Normal phase chromatography Stationary phase: nonpolar Elution order: polar proteins -> nonpolar Stationary phase: polar Elution order: nonpolar -> polar 유기용매/salt의 농도

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Modes of chromatography – Reversed phase (RP)

• Tryptic peptide mapping of glutathione transferase isoenzymes by reversed phase chromatography

HI)

• 소수성 상호 작용 크로마토 그래피 (HIC; 흡착 크로마토 그래피의 한 종류) 분리 단백질 옥틸 (강한 소수성) 또는 페닐 (보다 약한 소수성) 기와 같은 소수성 정지상과 단백질 표면의 소수성 상호 작용을 사용. 

• 샘플에는 황산 암모늄과 같은 고농도의 극성이 높은 그룹이 존재하는데, 이는 단백질과 소수성 정지상 사이의 소수성 상호 작용을 촉진합니다. 

• 샘플 성분 은 소수성 상호 작용을 점차적으로 방해하는 극성의 구배 (예 : 2 M의 황산 암모늄-> 0 M)로 용리됩니다. 

 http://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA

(HI) • Mono-S 양이온 교환 크로마토 그래피 후 소수성 상호 작용 크로마토 그래피에 의한 뱀 독 포스 포 리파제 A2의 정제. 피크 1은 포스 포 리파제 A2 활성을 함유 하였다. 구배 B (20mM 트리스 pH 7.2; 암모늄 설페이트 농도로 역전) 역상 대 소수성 상호 작용

크로마토 그래피 역상 소수성 상호 작용 • 용출은 이동상의 특성으로 인해 발생하며 일반적으로 소수성입니다. • 단백질은 일반적으로 변성됩니다. • 단백질의 총 소수성에 따라 달라지며, 이는 1 차 구조에 의해 결정된 단백질의 고유 속성입니다. • 분석 응용에 유용합니다. • 용리는 단백질 표면의 그룹과 고정상 사이의 소수성 상호 작용을 부드럽게 중단시킵니다. • 기본 단백질 구조와 기능을 유지합니다. • 준비 기술로 단백질 정제에 적용 할 수 있습니다.