생물물리화학방법론 -Ion exchange

Ion exchange-pi value가다르기 때문에 어떠한 종류를 선택하는지 중요 PH와 Anion /Cation exchanger 패턴분석 중요

Gel filtration - size로분리

salt제거 buffer exchange , native mass알고자할때, elution volume 반비례 관계 성립 효과적인 레진 이용 로그관계식 얻음

reversed/ hydrophobic 일루션할때 하는 용액이 다름 유기용매에서 프로틴은 약함 -peptide oligo  / 솔트의 농도를 높은곳에서 낮은곳

affinity-결합정도 =두개 물질 사이에 분리 정제/ specific= GST enzyme /글루타치온에 결합할려는 성질이용 specific결합

• 친화력: 입자가 결합하게 하는 유인력 또는 힘. 생화학에서의 생물학적 인식.

• 친화 크로마토그래피는 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 단백질(또는 단백질 그룹)과 특정 리간드 사이의 가역적 상호작용에 기초하여 단백질을 분리한다.

크로마토그래피 모드 – 선호도

• 리간드의 고정화 1) 정지 단계의 활성화(예: 아가로오스)

크로마토그래피 모드 – 선호도

• 리간드의 고정화 2) 리간드의 기능적 그룹을 이용하여 리간드의 부착을 활성화한다.

–NH2, – SH, – COOH 및 –OH로 구분하십시오. 경우에 따라서는 고정된 리간드에 단백질의 친화력을 전혀 유도하지 않는 리간드와 단백질 사이의 돌기적 장애를 피하기 위해 리간드와 고정된 위상 입자 사이에 어느 정도의 거리를 도입할 필요가 있다. protein A가 레진에 부착되어야함 activation CNBR을 이용 -amino group과 reative 하게 결합 아미노 ,카복실에 결합 라이신을가지고 있있는 것과 결합, 부착 하나의 component와 레진을 부착

크로마토그래피 모드• 친화력 크로마토그래피는 단백질을 한 단계씩 정화하는 가장 효과적인 방법 중 하나로 간주되며, 그 결과 단백질의 특수성이 높다.

• 비특정적이고 낮은 친화성 방식으로 정지 단계에 결합될 수 있는 오염물을 제거하기 위한 세척 단계를 따른다.

• 용출은 리간드 결합 정지 단계에서 관심 있는 단백질을 제거한다.

• 리간드로부터 결합된 단백질을 윤활하기 위해 다음과 같이 사용한다. ✓ pH 변화 ✓ 이온 상호작용 강도의 변화 ✓ 우레와 같은 차오트방성 시약(참고: 가혹한 조건을 사용하면 정제할 단백질의 생물학적 활동이 상실될 수 있음) ✓ 보다 젠틀한 접근법으로서 이동상에서의 친화력 리간드. 선호도 리간드가 있는 그라데이션은 리간드에 대해 서로 다른 친화력을 보이는 여러 종류의 이소젠질을 정화하기 위해 사용된다.

크로마토그래피 모드 – 선호도

그리고 트롬빈 갈라진 부위는 나오게된다.

-내가 원하는 프로틴을 선별적으로 분리 정제 .

〇 GST태그단백질 정화

• 고정 금속 친화 크로마토그래피(IMAC)

✓ Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+ 등의 금속은 iminodicetic acid(IDA), NTA(Nitrilotriacetic acid) 등의 그룹에 부분 체액하여 정지 단계로 고정시킨다.

✓ 2-3 부위는 히스티딘, 시스테인, 트립토판이 함유된 결합 단백질로 금속의 절제를 위해 사용할 수 있다(예: His6 태그가 붙은 단백질).-쉽게 결합하는 물질 내가 원하는 프로틴만 결합

✓ 단백질은 IMAC 정지단계에서 가장 잘 결합된다.

중성 또는 알칼리 pH 값.-ph를 조정하여 일루션 ✓ 용출은 경쟁하는 이미다졸과 함께 발생한다.금속 절제를 위한 단백질

✓ 금속은 EDTA로 벗겨질 수 있으며, 정지상(agarose)은 금속으로 재충전하여 또 다른 한 차례의 크로마토그래피를 할 수 있다.-프로틴과 히스티딘 결합 /레진을 재사용

크로마토그래피 모드 – 선호도

• His-tag를 사용한 단백질의 IMAC3 부 : 크로마토 그래피 장비의 2 장. 크로마토 유형그래피 크로마토 그래피 장비의 유형 • 개방 컬럼 크로마토 그래피 (대기압 , 주사기, 연동 펌프 사용) • 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)

• 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)대량 x  cf) 수지 원심 분리 , 자성 비드 개방 컬럼 크로마토 그래피

•에서 작동하는 크로마토 그래피 시스템을

사용하여 대기압 (중력 기준) 직경비교적 큰 (예 : 50-150 um) 고정상 입자를 이 개방 컬럼 크로마토 그래피 또는 저 성능 액체 크로마토 그래피라고합니다. -중력에 의해 프로틴이 정제되고, 모바일페이스가 빨리 내려가야함 레진의 사이즈가 커야함 :가격이 쌈

• 수지는 다당류 기반 젤이며 고압을 견딜만큼 충분히 강하지 않습니다.

• 해상도비교적 높고 해상도 가가가 속도느립니다 높은 시스템에 비해.

• 유량은 연동 펌프 또는 저장소의 액체 부피로 제어 할 수 있습니다.

• 개방 컬럼 크로마토 그래피 시스템은 값이 싸고 용량이 크기 때문에 산업 규모의 단백질 정제 (제약 목적, 진단 또는 실험 실용 또는 식품 및 양조의 첨가제)에 적합합니다. => 단백질의 다운 스트림 처리

연동 펌프

H : 이론적 페이트의 높이 H1: 와상 확산의H2기여: 이동상 물질 전달의H3기여: 정체 이동상 물질 전달의H4기여: 고정상 질량 전달의 기여

• 작은 H-> 크로마토 그래피 성능 향상

• 전체 플레이트 높이 방정식에 대한 주요 기여H3하는 는 입자 직경의 제곱정비례 (dp2)에입니다.흡착 / 탈착 동역학 작은 입자 직경을 갖는 정지상에서및 그에 따른 크로마토 그래피 성능이 상당히 개선 될 것으로 예상된다.

그러나 직경이 작을수록 유속이 크게 줄어 듭니다. => 고압, 배압 긴 체류 시간

• 실리카 계 입자 (직경 5-10 μ의m)은 적극적으로 높은 압력 (최대 55 Mpa로까지) 하에서 이동상을 펌핑함으로써 달성 높은 유속의 사용을 허용한다. 1 MPa = ~ 9.9 atm

• 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 고해상도를 위해 작은 입자 직경 입자와 고압의 조합을 사용합니다.

다색 (다이오드 어레이) 검출기 UV / Vis 검출기 용매 HPLC 용매 전달 시스템 저장통

인젝터 HPLC 컬럼

높음 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)HPLC에 •사용되는 고정상 입자

고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) • HPLC에 사용되는

액체상 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) HPLC의

한계HPLC

•높은 해상도와 인상적인 다양성으로 인해 널리 보급되었습니다 생화학, 분석 및 유기 화학 및 기타 과학 연구 분야의 기술.

• HPLC는 특히 의 분리 및 분석에 유용합니다 저 분자량 바이오 분자 대사 중간체, 바이오 폴리머의 빌딩 블록 및 펩타이드 혼합물의 분석과 같은.

• 그러나원칙적으로 가능하지만 복잡한 바이오 폴리머를정제하는 것은비현실적입니다 단백질과 같은활성 형태로.

✓ 일반적인 HPLC 방법에는시키는 유기 용매를 사용해야 단백질을 변성합니다.

✓ 대용량 HPLC 컬럼을 사용할 수 있지만 비용이 많이 들고 소용량 분석 컬럼이 훨씬 일반적입니다 (최대 200 μg의 샘플).

고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)

• Pharmacia Biotech (현재 GE Healthcare)개척했습니다 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 는 활성 바이오 폴리머 정제의 특정 요구를 해결하기 위해(FPLC)를.

•이 크로마토 그래피 형식은 원래 단백질 정제 용으로 개발되었지만 DNA (플라스미드, 제한 단편 및 올리고 뉴클레오티드), 뉴클레오티드 유도체 (예 : NAD, ATP), 탄수화물을 포함한 다양한 다른 생체 분자의 정제에도 사용되었습니다. 펩티드 및 다른 저 분자량 생체 분자로서.

• 컬럼 : 겔 여과, 친 화성, IMAC, 이온 교환,

고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) -빠르게 분리정제

• 유사성 ✓ 작은 입자 직경 고정상 사용 (5–13 μm) ✓ 다양한 크로마토 그래피에서 사용 가능 모드 ✓ 이동상 흐름은에서 발생 가압 시스템합니다 ✓ 샘플 및 완충액 성분은 크로마토 그래피 전에 여과가 필요합니다

• HPLC와 FPLC의 차이점 ✓FPLC는 바이오 폴리머의 요구에 맞게 특별히 설계되었습니다. ✓ 주로 수성 용매가 사용됩니다. 고정상은 비교적 큰 적재 용량을 갖는다. ✓FPLC는 HPLC보다 훨씬 낮은 압력에서 작동합니다. ✓ 누출은 덜 일반적입니다.

관류 크로마토 그래피

• 크로마토 그래피 성능은 입자 크기를 줄임으로써 향상되지만 시스템의 실제 압력 제한으로 인해 3–5 μm의 하한이 부과됩니다. -안쪽으로

•이 제한은 관류를 사용하여 극복됩니다. POSOS (Perfusive 고정상 입자)는 이동상의 빠른 확산을 촉진하는 큰 채널을 포함하여 매우 높은 유속, 적은 배압 및 짧은 작동 시간을 허용합니다.